Die Vitrifikation war keine einzelne Erfindung. Sie entwickelte sich, als Forschende nach und nach verschiedene Probleme lösten: zunächst bei Zellen und Embryonen, dann bei Organen und schliesslich bei der Biostase des Menschen.
Das Ziel klingt einfach: wasserreiches Gewebe durch Abkühlen in einen glasartigen Zustand überführen, ohne dass dabei schädliche Eiskristalle entstehen.
Die Umsetzung ist es nicht. Kryoprotektiva können toxisch wirken. Ihre Zufuhr kann Zellen verformen. Grosse Proben kühlen ungleichmässig ab und lassen sich nur schwer wieder erwärmen. Dabei entstehen mechanische Spannungen.
Moderne Verfahren erfordern deshalb mehrere aufeinander abgestimmte Schritte. Wie gut sie funktionieren, hängt von der chemischen Zusammensetzung der Lösungen, der Perfusion, der Temperaturführung, dem zeitlichen Ablauf, der Form der Probe und den begleitenden Messungen ab.
Vor der Vitrifikation: zusätzliche Schäden durch Kälte
Frühe Kryokonservierung bedeutete meist Einfrieren. Die Kühlung verlangsamte chemische Reaktionen, doch das Wasser gefror.
Eis verdrängt Salze und andere gelöste Stoffe in die verbleibende Flüssigkeit. Dabei werden Zellen mechanisch verformt und extrem hohen Konzentrationen gelöster Stoffe ausgesetzt. Sie verlieren Wasser, und ihre Membranen können Schaden nehmen.
Bei schnellerer Kühlung bleiben die Eiskristalle kleiner. Wasser ohne schützende Zusätze muss jedoch ausserordentlich schnell abgekühlt werden, um in einen glasartigen Zustand überzugehen. Das funktioniert nur bei extrem dünnen Proben.
Das historische Problem bestand nicht nur darin, eine tiefe Temperatur zu erreichen. Die Schwierigkeit lag darin, diese Temperatur zu erreichen, ohne dass sich schädliche Eiskristalle bilden.
1937 bis 1938: die ersten kinetischen Vitrifikationsversuche
Basile Luyet schlug die Vitrifikation 1937 als Strategie zur biologischen Konservierung vor.
1938 berichteten Luyet und Eugene Hodapp, dass Froschspermien wieder beweglich waren, nachdem ihnen mit einer konzentrierten Saccharoselösung Wasser entzogen worden war und sie anschliessend flüssiger Luft ausgesetzt worden waren.
Das ursprüngliche Experiment wurden mikroskopisch dünne Flüssigkeitsfilme mit extrem hoher Geschwindigkeit abgekühlt. Es zeigte, dass das Verfahren physikalisch möglich war, lieferte aber noch kein auf Organe übertragbares Protokoll.
Dieser Ansatz heisst heute kinetische Vitrifikation: Der Probe wird Wärme schneller entzogen, als sich Eiskeime bilden und Kristalle wachsen können.
An der Grösse scheitert das Verfahren. Mit zunehmender Probengrösse wächst das Volumen stärker als die Oberfläche. Deshalb kühlt das Innere einer grossen Probe zu langsam ab.
1949: Glycerin eröffnet neue Möglichkeiten
Christopher Polge, Audrey Smith und Alan Parkes entdeckten 1949, dass Glycerin Spermien während der Konservierung bei tiefer Temperatur schützen kann.
Ihr Bericht in Nature zeigte, wie sich Kryoprotektiva, die in Zellen eindringen, praktisch nutzen lassen.
Diese Moleküle gelangen in Zellen, binden Wasser und verringern die Eismenge, die sich bei einer bestimmten Temperatur bildet. Sie senken zudem die schädliche Konzentration gelöster Stoffe beim Einfrieren.
Die Entdeckung veränderte die Kryobiologie grundlegend, weil die Kühlrate nicht mehr die einzige Stellgrösse war. Durch eine veränderte chemische Zusammensetzung liess sich beeinflussen, unter welchen Bedingungen Wasser gefriert oder glasartig erstarrt.
Sie warf zugleich ein neues Optimierungsproblem auf. Eine höhere Konzentration des Kryoprotektivums verhindert die Eisbildung wirksamer, verstärkt aber chemische und osmotische Schäden.
1959 bis 1968: mehr Wirkstoffe und stufenweise Zufuhr
1959 berichteten James Lovelock und Marcus Bishop, dass Dimethylsulfoxid mehrere Zelltypen vor Gefrierschäden schützt.
DMSO durchdrang manche Membranen leichter als Glycerin. Damit liessen sich weitere Zelltypen vor Gefrierschäden schützen. DMSO wird bis heute in Labor und Klinik häufig eingesetzt.
John Farrant untersuchte anschliessend ein Verfahren, bei dem die Konzentration des Kryoprotektivums erhöht und zugleich die Temperatur gesenkt wurde. So blieb das Gewebe in einer konzentrierten, flüssigen Lösung, ohne dass gezielt eine Eisbildung ausgelöst wurde.
Damit nahm er ein zentrales Merkmal moderner Protokolle vorweg: die stufenweise Zufuhr des Kryoprotektivums bei tiefer Temperatur, statt warmes Gewebe sofort der vollen Konzentration auszusetzen.
Stufenweise Zufuhr begrenzt den osmotischen Schock. Bei tieferer Temperatur laufen viele chemische Reaktionen langsamer ab, sodass das Gewebe die Behandlung besser verträgt.
1968 zeigten Experimente, dass sich rote Blutkörperchen bei ausreichend hoher Glycerinkonzentration auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff abkühlen liessen, ohne dass sichtbares Eis entstand.
Die Grundlagen des Verfahrens waren damit bekannt. Es fehlte jedoch ein praktikables Verfahren für komplexes, durchblutetes Gewebe.
1984: Die Vitrifikation wird zur Strategie für Organe
Die Arbeit von 1984, «Vitrification as an Approach to Cryopreservation», stellte die Vitrifikation als aussichtsreiches Verfahren für den Aufbau von Organbanken vor.
Die Strategie wurde teils Gleichgewichtsvitrifikation genannt. Eine ausreichend hohe Konzentration des Kryoprotektivums sollte die erforderliche Kühlrate so weit senken, dass sie auch bei grösseren Proben technisch erreichbar wäre.
Dieser Ansatz machte drei miteinander verknüpfte Anforderungen deutlich:
- Die Lösung muss bei technisch erreichbaren Kühl- und Erwärmungsraten eisfrei bleiben.
- Das Organ muss das Zuführen und Entfernen dieser Lösung vertragen.
- Das Kryoprotektivum muss jede Region erreichen, bevor die Kühlung beginnt.
Eine Lösung konnte im Reagenzglas hervorragend funktionieren und im Organ dennoch versagen, etwa wegen eines hohen Gefässwiderstands, langer Diffusionswege oder toxischer Wirkungen.
1985: Embryonen überleben die Vitrifikation
William Rall und Gregory Fahy berichteten 1985 über die eisfreie Kryokonservierung von Mausembryonen bei −196 °C.
Das war ein entscheidender biologischer Nachweis. Lebende Säugetierzellen mit Zellkern überstanden die Abkühlung bis zur vollständigen Vitrifikation und die anschliessende Wiedererwärmung.
Embryonen sind allerdings sehr klein. Bei ihnen lassen sich Temperatur und Konzentration schneller und gleichmässiger verändern als bei einem Organ eines ausgewachsenen Tiers.
Das Ergebnis bestätigte die Methode und machte gleichzeitig das Grössenproblem deutlicher sichtbar.
Bei grösseren Proben stellen sich vier Teilprobleme
1. Toxizität der Kryoprotektiva
Die für die Vitrifikation nötige Konzentration kann Proteine, Membranen und den Zellstoffwechsel stören. Die Toxizität hängt von Wirkstoff, Konzentration, Temperatur, Einwirkzeit und Gewebetyp ab.
Das heisst: Wie toxisch ein Kryoprotektivum wirkt, hängt nicht allein vom Molekül ab. Entscheidend ist auch, wie das Kryoprotektivum zugeführt und wieder entfernt wird.
2. Osmotischer Stress
Wird eine konzentrierte Lösung zugeführt, verlieren die Zellen Wasser. Beim Entfernen der Lösung kann Wasser zu schnell in die Zellen zurückströmen.
Moderne Protokolle begrenzen Veränderungen des Zellvolumens durch abgestufte Konzentrationen, Trägerlösungen, eine kontrollierte Temperatur und gelöste Stoffe, die nicht in die Zellen eindringen.
3. Ungleichmässige Verteilung
In einem Organ verteilt sich eine Lösung nicht so gleichmässig wie in einem Gefäss. Das Kryoprotektivum bewegt sich durch Gefässe, überwindet Kapillarwände und diffundiert durch Gewebe.
Gerinnsel, Ödeme, Gefässerkrankungen, Ischämie und die Blut-Hirn-Schranke können verhindern, dass in allen Geweberegionen die zur Vermeidung von Eisbildung nötige Konzentration erreicht wird.
Deshalb werden bei moderner Perfusion Druck, Durchfluss, Temperatur und die Konzentration im venösen Abfluss gemessen. Die zugeführte Lösungsmenge allein reicht zur Beurteilung nicht aus.
4. Thermische Gradienten
Ein grosses Objekt kühlt von aussen nach innen ab. Dabei ziehen sich die einzelnen Bereiche unterschiedlich stark zusammen.
Nahe und unterhalb des Glasübergangs kann das Material Spannungen nicht schnell abbauen. Übersteigt die Spannung die mechanische Festigkeit, können Risse entstehen.
Abhilfe schufen eine kontrollierte Kühlrate, ein Temperaturausgleich nahe der Glasübergangstemperatur Tg und eine langsamere weitere Abkühlung im glasartigen Zustand. Diese Prinzipien prägen heute die computergesteuerte Kühlung beim Menschen.
1990er und 2000er Jahre: Mischungen statt einzelner Wirkstoffe
Kein einzelnes Kryoprotektivum erfüllte alle Anforderungen zugleich. Forschende kombinierten zunehmend mehrere Wirkstoffe, die in Zellen eindringen. So konnte jeder zur Schutzwirkung beitragen, ohne in der hohen Konzentration eingesetzt werden zu müssen, die bei alleiniger Verwendung nötig gewesen wäre.
Mit Trägerlösungen liessen sich die Ionenzusammensetzung, der pH-Wert und die osmotischen Bedingungen einstellen. Polymere, die nicht in die Zellen eindringen, beeinflussten den Wasserhaushalt des Gewebes und die Eigenschaften der Gefässe.
Synthetische Eisblocker griffen gezielt in die heterogene Eiskeimbildung und das Eiswachstum ein. Damit hing die Vermeidung von Eisbildung weniger stark von der Konzentration der Kryoprotektiva allein ab.
Bei Lösungen wie VS55 und später M22 wurden mehrere Wirkstoffe, Eisblocker und die Zusammensetzung der Trägerlösung aufeinander abgestimmt und mit festgelegten Perfusions- und Temperaturprotokollen kombiniert.
Ein Übersichtsartikel zur Organvitrifikation von 2004 beschreibt Fortschritte bei der Verringerung toxischer Wirkungen und kältebedingter Schäden, bei der Kontrolle der Eiskeimbildung und bei der Organperfusion.
Der wichtige Fortschritt war nicht, dass die Toxizität verschwand. Forschende lernten, die Belastung durch eine abgestimmte Wahl von Lösungszusammensetzung, Einwirkzeit und Temperatur zu verringern.
Kaninchenniere: ein bedeutsamer Erfolg, der leicht überschätzt wird
Versuche mit Kaninchennieren zeigten, dass sich ein durchblutetes Säugetierorgan mit einer komplexen Vitrifikationslösung durchtränken, durch Abkühlen in einen glasartigen Zustand überführen, wieder erwärmen und transplantieren liess.
In einem dokumentierten Versuch übernahm die transplantierte Niere über einen längeren Zeitraum als einzige funktionierende Niere die Nierenfunktion des Kaninchens.
Dieses Ergebnis ist bedeutsam, weil damit über Versuche an mikroskopischen Proben hinaus gezeigt wurde, dass ein Organ nach der Vitrifikation wieder funktionieren kann. Daraus entstand jedoch noch kein zuverlässiges klinisches Verfahren.
Die spätere Fachliteratur hält fest, dass ein langfristiger Transplantationserfolg nicht reproduzierbar erreicht wurde. Die Verteilung der Schutzlösung, ihre Toxizität und die übliche Wiedererwärmung von der Oberfläche her begrenzten weiterhin den Erfolg.
Damit liegt ein bedeutender Machbarkeitsnachweis vor. Die zuverlässige Wiederholung und die Übertragung auf grössere Organe bleiben jedoch ungelöst.
2015: Die Qualität der Konservierung wird auf synaptischer Ebene sichtbar
Die aldehydstabilisierte Kryokonservierung verband chemische Fixierung, Kryoprotektivum-Perfusion und Vitrifikation in Kaninchen- und Schweinehirnen.
Die Studie von 2015 zeigte, dass nach der Wiedererwärmung und Aufbereitung für die Elektronenmikroskopie Membranen, Synapsen, Vesikel, Myelin und intrazelluläre Strukturen klar erkennbar waren.
Sie zeigte, dass die neuronale Feinstruktur auch in grossen Gehirnen nach eisfreier Lagerung und Wiedererwärmung sehr gut erhalten sein kann.
Eine Wiederherstellung der Lebensfähigkeit wurde damit nicht nachgewiesen. Bei der Aldehydfixierung werden biologische Moleküle gezielt miteinander vernetzt. Eine Wiederherstellung der Lebensfunktionen ist danach mit herkömmlichen Verfahren nicht möglich.
Das Experiment zeigte somit, wie gut die Strukturen erhalten blieben. Ob eine Wiederbelebung möglich wäre, beantwortete es nicht.
Daraus ergab sich eine allgemeinere methodische Erkenntnis: Die Qualität der Konservierung sollte direkt an den Strukturen beurteilt werden, die erhalten bleiben sollen. Ein glasartiges Aussehen allein genügt nicht.
2023: Nanoerwärmung löst das Wiedererwärmungsproblem bei Rattennieren
Für eine reversible Kryokonservierung genügt es nicht, das Gewebe unbeschadet abzukühlen. Die anschliessende Wiedererwärmung ist oft schwieriger.
Erwärmt man zu langsam, kann während der Devitrifikation Eis wachsen. Kommt die Wärme vor allem von der Oberfläche, können thermische Gradienten das Organ zum Reissen bringen.
Bei der Nanoerwärmung werden Eisenoxid-Nanopartikel über die Gefässe verteilt und durch ein hochfrequentes magnetisches Wechselfeld erwärmt. So lassen sich beide Probleme lösen.
2023 haben Forschende Rattennieren vitrifiziert, bis zu 100 Tage gelagert, per Nanoerwärmung wiedererwärmt und transplantiert.
Die transplantierten Nieren übernahmen während des dokumentierten Nachbeobachtungszeitraums die lebensnotwendige Nierenfunktion bei Empfängertieren, deren eigene Nieren entfernt worden waren.
Der Erfolg beruhte auf mehr als der Erwärmung allein. Das Team verwendete eine weniger toxische Lösung und modellierte die Zufuhr des Kryoprotektivums, um die gewünschte Konzentration im Gewebe besser zu erreichen.
Die Geschichte der Vitrifikation zeigt immer wieder: Ist ein Problem gelöst, tritt das nächste hervor. Erfolg ist nur möglich, wenn alle Verfahrensschritte aufeinander abgestimmt sind.
2024 bis 2026: grössere physikalische Systeme und funktionsfähiges Nervengewebe
2024 berichteten Forschende über Vitrifikationsversuche mit Volumina von 0,5 bis 3 Litern, die der Grösse menschlicher Organe entsprechen. Untersucht wurden dabei die physikalischen Eigenschaften.
Sie kombinierten Temperaturmessungen im Inneren der Proben mit einem Temperaturausgleich, kontrollierter Kühlung und Untersuchungen mittels Mikro-CT. Zudem zeigten sie Nanoerwärmung in Volumina bis zu 2 Litern.
Bei den Versuchen mit den grössten Volumina ging es vor allem um die physikalische Machbarkeit. Sichtbares Eis und Risse müssen zwar vermieden werden. Das allein zeigt aber noch nicht, dass sich die Funktion eines Organs von menschlicher Grösse wiederherstellen lässt.
2026 berichtete eine Studie in PNAS über die kurzfristige funktionelle Wiederherstellung von Hippocampus-Gewebe erwachsener Mäuse nach Vitrifikation und Wiedererwärmung.
Die Studie erfasste Morphologie, mitochondriale Reaktionsfähigkeit, neuronale Erregbarkeit, synaptische Übertragung und Langzeitpotenzierung.
Untersucht wurden Hirnschnitte von Mäusen sowie Präparate ganzer Mäusegehirne, bei denen die Erfolgsquote gering war. Menschliche Gehirne wurden nicht untersucht. Die Aussagekraft ist damit begrenzt, das Ergebnis bleibt jedoch bedeutsam.
Die Studie zeigte, dass Nervengewebe erwachsener Säugetiere nach Vitrifikation und Wiedererwärmung wieder elektrophysiologisch aktiv sein kann, obwohl die molekulare Beweglichkeit im glasartigen Zustand zuvor zum Stillstand gekommen war.
Bei der Biostase des Menschen sind die Bedingungen schwieriger
Bei Experimenten zur Lagerung von Organen steht zu Beginn gesundes Gewebe zur Verfügung. Der Zeitpunkt des Eingriffs und der Gefässzugang lassen sich im Voraus planen.
Die Biostase des Menschen beginnt, nachdem der Tod nach den geltenden rechtlichen Vorgaben festgestellt wurde. Krankheit, warme Ischämie, Gerinnung, Ödeme, Transport und Gefässerkrankungen können die Zufuhr des Kryoprotektivums beeinträchtigen.
Das unmittelbare Ziel ist, die Gewebestrukturen zu erhalten, damit Schäden künftig möglicherweise behoben werden können. Das Gewebe soll nicht schon heute wieder funktionsfähig gemacht und transplantiert werden.
Dieser Unterschied ist der Grund, weshalb sich Aussagen aus dem Labor nicht direkt auf Patienten übertragen lassen.
Wie Tomorrow.bio die Vitrifikation für den Einsatz vor Ort anpasste
Tomorrow.bio verlegte die kryoprotektive Perfusion des ganzen Körpers in speziell ausgerüstete Ambulanzfahrzeuge. Die Perfusion kann so bereits vor Ort beginnen, bevor der Patient in die Schweiz transportiert wird.
Dadurch lässt sich die Ischämie vor Beginn der Perfusion begrenzen. Ihre Folgen können später durch die Schutzlösung nicht rückgängig gemacht werden.
Das aktuelle Protokoll verwendet eine auf VM-1 basierende Lösung, die für die Kryoprotektion vor Ort und den anschliessenden Transport auf Trockeneis angepasst wurde.
Ein Forschungsprogramm der EBF hat VM-1 unter simulierten Bedingungen nach dem Tod getestet, unter anderem nach einer warmen Ischämie von dreier Stunden Dauer.
Dabei wurden der Brechungsindex im venösen Abfluss, die Perfusionsdauer, Gewichtsveränderungen, die Schrumpfung des Gehirns und die Eisbildung gemessen, um Anpassungen der Perfusionslösung und des Verfahrens zu untersuchen.
Bei der Anwendung am Menschen ist deshalb entscheidend, wie gut sich ein Körper nach einer Ischämie noch perfundieren lässt. Ob eine Lösung unter idealen Bedingungen vitrifiziert, reicht als Kriterium nicht aus.
Messungen werden Teil des Verfahrens
In der frühen Vitrifikationsforschung wurde der Erfolg häufig anhand der Transparenz der Proben, durch Kalorimetrie oder Röntgenbeugung sowie anhand der Lebensfähigkeit oder Funktion nach der Wiedererwärmung beurteilt.
Bei der Biostase des Menschen lässt sich die Qualität der Konservierung heute nicht daran beurteilen, ob eine Wiederbelebung gelingt. Deshalb braucht es zerstörungsfreie Untersuchungen und Stichproben, um die Qualität der Konservierung zu beurteilen.
Tomorrow.bio untersucht jeden Patienten mittels CT bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff. Unter diesen standardisierten Bedingungen lassen sich die Verteilung des Kryoprotektivums abschätzen sowie Eis und makroskopische Schäden erkennen.
Mit gesonderter Einwilligung können kleinste Proben von Nervengewebe entnommen werden, um Membranen, Synapsen und die lokale Feinstruktur elektronenmikroskopisch zu beurteilen.
Diese Methoden und ihre Grenzen werden im Beitrag «Qualitätskontrollverfahren der Biostase» beschrieben.
Solche Messungen helfen auch, die Verfahren weiterzuentwickeln. Wenn sich Fehler erkennen und zwischen einzelnen Fällen vergleichen lassen, können die Zusammensetzung der Schutzlösung und das Protokoll gezielt verbessert werden.
Was sich verbessert hat und was noch ungelöst ist
Die moderne Vitrifikation hat einiges erreicht, was mit dem frühen Einfrieren nicht möglich war:
- Eisfreie Konservierung vieler Zellen, Embryonen und kleiner Gewebeproben.
- Funktionelle Wiederherstellung vitrifizierter Tierorgane in definierten Experimenten.
- Strukturerhalt auf synaptischer Ebene in fixierten Säugetiergehirnen.
- Computergesteuerte Kühlung und Temperaturausgleich grösserer Systeme.
- Volumetrische Wiedererwärmung durch Verfahren wie die Nanoerwärmung.
- CT und Elektronenmikroskopie zur Beurteilung der tatsächlich erreichten Konservierungsqualität.
Eine reversible Kryokonservierung des gesamten menschlichen Körpers hat sie nicht hervorgebracht.
Zu den verbleibenden Problemen zählen postmortale Ischämie, ungleichmässige Perfusion, Toxizität der Kryoprotektiva, Effekte der Blut-Hirn-Schranke, thermische Gradienten im ganzen Körper, die Vermeidung von Rissen und eine sichere, gleichmässige Wiedererwärmung.
Selbst wenn die Gewebestrukturen erfolgreich erhalten blieben, wäre weiterhin ungeklärt, wie sich Schäden beheben, der Mensch wiederbeleben und die ursprüngliche Todesursache behandeln liessen.
Diese Unterschiede werden im Beitrag «Technische Herausforderungen für reversible Kryokonservierung» näher erläutert.
Kurz gesagt: Die Vitrifikation wurde durch bessere Kryoprotektiva sowie Fortschritte bei der Perfusion, der Vermeidung von Eisbildung, der Kühlung, der Wiedererwärmung und der Untersuchung der Gewebestrukturen weiterentwickelt. Bei kleinen Proben sind manche Probleme bereits gelöst. Wie sich ein ganzer Mensch reversibel kryokonservieren liesse, ist weiterhin ungeklärt.
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