Nach der kryoprotektiven Perfusion wird ein Patient nicht einfach in flüssigen Stickstoff gelegt.
Der Patient durchläuft ein computergesteuertes Temperaturprogramm, das mehrere Tage dauert. Sensoren im Körper des Patienten zeigen, ob die verschiedenen Körperregionen gleichmässig abkühlen oder ob sich gefährliche Temperaturunterschiede bilden.
Mit sinkender Temperatur ändern sich die technischen Anforderungen. Die frühe Kühlphase soll die Eisbildung begrenzen. Nahe und unterhalb des Glasübergangs zählen Präzision und thermische Gleichmässigkeit mehr als Geschwindigkeit.
Weshalb kontrollierte Kühlung notwendig ist
Kryoprotektiva senken die Mindestgeschwindigkeit, mit der das Gewebe abgekühlt werden muss, um Eisbildung zu verhindern. Sie ermöglichen es, wasserreiches Gewebe in einen hochviskosen, glasartigen Zustand zu überführen, ohne dass es dabei weitgehend kristallisiert.
Die Glasübergangstemperatur Tg hängt von der verwendeten Lösung, deren Konzentration und der Messmethode ab. Der Glasübergang erstreckt sich über einen Temperaturbereich; eine allgemeingültige biologische Temperaturschwelle gibt es dafür nicht.
Bei Lösungen, die für die menschliche Kryokonservierung relevant sind, liegt dieser Bereich meist zwischen −120 °C und −135 °C.
Wird oberhalb dieses Bereichs zu langsam gekühlt, können Eiskeime entstehen und Eiskristalle wachsen. Darunter verhält sich das Material zunehmend wie ein spröder Festkörper.
Kühlt die Oberfläche viel schneller ab als das Zentrum, ziehen sich die Regionen unterschiedlich stark zusammen. Die entstehende thermomechanische Spannung kann Risse verursachen.
Die Abkühlung muss daher zunächst schnell genug erfolgen, um Eisbildung zu begrenzen; beim Übergang des Gewebes in den glasartigen Zustand müssen Temperaturgradienten und Abkühlrate sorgfältig kontrolliert werden.
Welche Phasenübergänge dabei auftreten, erläutert der Artikel über den Unterschied zwischen Einfrieren und Vitrifikation.
Die erste Kühlbox-Generation
Mit der V1-Kühlbox führte Tomorrow.bio den grundlegenden Aufbau für die kontrollierte Abkühlung des gesamten Körpers ein.
Der Patient liegt in einer eigens dafür gebauten, isolierten Kammer. Ein Computer regelt die Temperatur in der Kammer, während Thermoelemente an mehreren Stellen messen.
Die Steuerung regelt die Kühlleistung nach einer vorgegebenen Temperaturkurve, statt durchgehend mit maximaler Leistung zu kühlen. Die Messwerte jedes Sensors werden aufgezeichnet, um den Temperaturverlauf im Körper des Patienten zu dokumentieren.
Das unterscheidet sich bereits grundlegend vom direkten Eintauchen. Je nach gemessenem Temperaturverlauf im Körper kann das System die Abkühlung verlangsamen, die Kammertemperatur konstant halten oder sie anpassen.
Das dewarbasierte System der zweiten Generation
Beim System der zweiten Generation von Tomorrow.bio erfolgt die kontrollierte Abkühlung in einem eigens dafür gebauten Dewargefäss.
Der Patient bleibt im Dewargefäss; im speziell konstruierten Deckel sind Kühltechnik, Computersteuerung, Ventile, Sensoranschlüsse und Durchführungen für Thermoelemente untergebracht.
Thermoelemente sind an mehreren Stellen im Körper des Patienten platziert. Weitere Sensoren überwachen die Temperaturverteilung im Inneren des Dewargefässes.
Das System erfasst somit auch die tatsächlichen Temperaturen im Körper. Es erfasst, wie schnell sich die Temperaturen an den einzelnen Messstellen im Körper verändern.
Der Computer passt den Temperaturgradienten und die Abkühlgeschwindigkeit im Dewar so an, dass diese Messwerte innerhalb des vom Protokoll erlaubten Bereichs bleiben.
Ein grosser Körper kann während der Kühlung nicht vollständig isotherm sein. Ziel ist es, die Temperaturunterschiede möglichst gering zu halten, damit keine der überwachten Körperregionen gefährlich schnell oder langsam abkühlt.
Die Bauform des Dewargefässes verringert zudem den Aufwand für das Umlagern des Patienten nach der kontrollierten Abkühlung. Die geschlossene Bauform kann zudem für stabile, räumlich gleichmässige Temperaturbedingungen um den Patienten sorgen.
Sollwerttemperatur ist nicht Patiententemperatur
Eine Steuerung kann die Umgebung rasch abkühlen. Sie kann das Zentrum eines menschlichen Körpers nicht sofort auf dieselbe Temperatur bringen.
Wärme muss aus dem tieferen Gewebe zur Oberfläche wandern. Geometrie, Körperzusammensetzung, Verteilung der Kryoprotektiva und Sensorposition beeinflussen die beobachtete Verzögerung.
Deshalb genügt ein einzelner Sensor in der Kammer nicht. Eine vorgegebene Umgebungstemperatur von −130 °C bedeutet nicht, dass an jeder Messstelle im Körper tatsächlich −130 °C erreicht sind.
Das Steuerungssystem muss sowohl die gemessenen Temperaturen als auch die Temperaturunterschiede zwischen den Messstellen berücksichtigen. Dabei ist sowohl auf die am langsamsten und am schnellsten abkühlenden Messstellen als auch auf die Temperaturverteilung insgesamt zu achten.
Auch die Kalibrierung und Platzierung der Thermoelemente sowie eine unterbrechungsfreie Messung sind wichtig. Unplausible Messwerte und Sensorausfälle sollten gekennzeichnet werden; fehlerhafte Daten dürfen nicht unbemerkt in die Temperaturkurve eingehen.
Das dreistufige Temperaturprogramm von Tomorrow.bio
Das aktuelle Protokoll umfasst drei klar getrennte Phasen. Die Werte gelten für die verwendete Anlage und das eingesetzte kryoprotektive Verfahren; sie lassen sich nicht auf jedes Vitrifikationssystem übertragen.
1. Rasche Abkühlung auf etwa −130 °C
In der ersten Phase wird der Patient von der Trockeneistemperatur auf etwa −130 °C abgekühlt, und zwar so schnell, wie es ohne gefährliche Temperaturunterschiede zwischen den Messstellen möglich ist.
Hier ist eine rasche Abkühlung wichtig, weil sich in unzureichend geschützten Körperregionen noch Eis bilden kann, bevor das Gewebe in den glasartigen Zustand übergeht.
Der Computer steuert die Abkühlung nicht allein nach einem festen Zeitplan. Er wertet die Messwerte der Thermoelemente aus und passt die Umgebungstemperatur entsprechend an.
2. Kontrollierte Wiedererwärmung auf etwa −120 °C
Nach Erreichen von etwa −130 °C wird die aktive Kühlung reduziert, sodass sich der Patient ohne aktive Wärmezufuhr wieder auf etwa −120 °C erwärmt.
Dies ist eine Temperphase. Nahe Tg sind die Moleküle im kryoprotektiv behandelten Material noch ausreichend beweglich, sodass sich die entstandenen mechanischen Spannungen teilweise abbauen können.
Während der Wiedererwärmung können sich zudem die Temperaturen wärmerer und kälterer Regionen angleichen, bevor das Material weiter abgekühlt wird und zunehmend erstarrt.
Bereits entstandene biologische Schäden lassen sich durch Tempern nicht rückgängig machen. Es dient dazu, Temperaturgradienten und Spannungen durch unterschiedlich starke Schrumpfung zu verringern.
3. Abkühlung auf −196 °C um etwa 1 °C pro Stunde
Ab etwa −120 °C beträgt die angestrebte Abkühlrate rund 1 °C pro Stunde, bis der Patient die Temperatur von flüssigem Stickstoff erreicht.
Die Abkühlung um diese letzten 76 Grad dauert selbst ohne Haltezeiten und Anpassungen der Kühlleistung rund drei Tage.
Damit ein grosser Körper mit unterschiedlichen Temperaturen in seinem Inneren um 1 °C pro Stunde abkühlt, muss die Kühlleistung laufend geregelt werden; ein fester Zeitplan genügt nicht.
Die Steuerung muss die Temperatur im Dewargefäss laufend anpassen, damit die Temperaturen an den Messstellen im Körper gleichmässig sinken und keine übermässigen Temperaturgradienten entstehen.
Kühlt eine Körperregion langsamer ab, kann eine stärkere Kühlung der Umgebung dazu führen, dass eine andere Region zu stark abkühlt. Für eine präzise Regelung müssen die Messwerte aller Sensoren berücksichtigt werden.
Weshalb die Temperphase wissenschaftlich plausibel ist
Bei der Vitrifikation grosser Proben stellen sich zwei Probleme, die unterschiedliche Kühlgeschwindigkeiten erfordern: zu langsame Abkühlung oberhalb von Tg und zu hohe mechanische Spannungen nahe und unterhalb von Tg.
Eine Vitrifikationsstudie von 2024 im Massstab menschlicher Organe erfasste die Temperatur mit mehreren Sonden im Inneren und kam zum Schluss, dass Tempern die Temperaturgradienten vor dem Übergang in die glasartige Phase verringert.
Dieselbe Studie zeigte, dass langsames Abkühlen unterhalb des Temperaturbereichs für das Tempern dazu beiträgt, die erneute Entstehung grosser Temperaturgradienten und Spannungen zu vermeiden.
Eine gesonderte thermomechanische Untersuchung ergab, dass Tempern nahe Tg die Restspannung deutlich verändert und ihre Abhängigkeit von der vorangegangenen Kühlrate abschwächt.
Diese Studien stützen die zugrunde liegende Steuerungsstrategie. Sie bestätigen jedoch nicht unabhängig jeden einzelnen Sollwert im Ganzkörperprotokoll von Tomorrow.bio.
Ein ganzer menschlicher Körper ist grösser und in seiner Zusammensetzung weniger einheitlich als eine im Labor untersuchte Lösungsprobe oder ein einzelnes Organ. Direkte Temperaturaufzeichnungen und bildgebende Verfahren nach der Abkühlung bleiben notwendig.
Was der Computer aufzeichnet
Eine Meldung wie «Abkühlung abgeschlossen» allein ist wenig aussagekräftig. Entscheidend sind die vollständigen Temperaturverläufe aller Messstellen.
Die Aufzeichnung sollte Abkühlraten, Haltephasen, Wiedererwärmungsphasen, Temperaturgradienten zwischen den Messstellen, Eingriffe der Steuerung, Alarme und sämtliche Abweichungen von der vorgegebenen Temperaturkurve dokumentieren.
Diese Daten fliessen in die Qualitätsbeurteilung der Kryokonservierung ein.
Nach der Abkühlung kann eine standardisierte Computertomografie bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff Aufschluss über die Verteilung der Kryoprotektiva geben sowie Eisbildung, grobe Verformungen und Risse sichtbar machen, die sich aus den Temperaturdaten allein nicht erkennen lassen.
Weshalb die Abkühlung bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff endet
Gemäss dem NIST Chemistry WebBook siedet Stickstoff bei normalem Atmosphärendruck bei etwa 77,34 Kelvin, entsprechend etwa −195,8 °C.
Die Lagerung in flüssigem Stickstoff ist passiv. Solange genügend flüssiger Stickstoff im Gefäss vorhanden ist, bleibt die Temperatur durch das Sieden auch ohne mechanische Kühlung stabil.
Die kontrollierte Abkühlung endet erst, wenn die Temperaturen im Körper eine sichere Überführung in die Lagerung erlauben. Die Lagerung ersetzt die Abkühlung nicht.
Wie die anschliessende Lagerung technisch umgesetzt wird und welche Vorzüge und Nachteile die verschiedenen Verfahren haben, erläutert der Artikel über moderne kryogene Dewargefässe und Lagerung bei Zwischentemperatur.
Kurz gesagt: Tomorrow.bio setzt computergesteuerte Kühlung und interne Temperatursensoren ein. Dabei wird der Patient zunächst rasch bis nahe an den Glasübergang abgekühlt; nach einer Phase zum Abbau thermischer Spannungen wird die Temperatur langsam weiter auf −196 °C gesenkt.
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Weiterführende Literatur